2003年，还在杭州艺校上学的叶祖新被选中出演《情断上海滩》而进入演艺圈。2005年，参演古装电视剧《李小环与苗翠花》，饰演方世玉；同年，参演古装宫斗电视剧《大清后宫》，饰演少年道光帝。2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》，饰演樊涛；参演古装历史电视剧《皇上二大爷》，饰演赵金山。2008年，参演战争历史电视剧《父亲的战争》，饰演彭龙。 2009年，参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》，饰演韦坚；同年参演家族斗争电视剧《大管家》，饰演李复修；参演战争历史电视剧《内线》，饰演苏子童。2010年，参演古装历史电视剧《大唐女巡按》，饰演欧阳；参演古装神话电视剧《活佛济公2》，分饰必清、瘦仙童两角；参演寻亲电视剧《杜鹃的女儿》，饰演小吴。 2011年，参演穿越电视剧《步步惊心》，饰演十爷；参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》，饰演淳贝勒。 2012年，参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》，饰演冷刚；参演传奇抗战题材电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》，饰演任松良；参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》，饰演叶公公；参演战争历史电视剧《向着胜利前进》，饰演何医生；参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》，饰演辛龙子；在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中饰演裴元庆。 2014年，参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》，饰演高富帅；参演都市爱情电视剧《步步惊情》，饰演JACK；参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》，饰演范大同；参演都市爱情电视剧《说好的幸福》，饰演许诺；参演古装历史传奇电视剧《隋唐英雄4》，饰演薛丁山。 2015年，1月参演《蜀山战纪之剑侠传奇》，饰演医术不凡的张馅饼 ；8月参演的抗日电视剧《铁在烧》在浙江、安徽卫视播出，饰演走上歧路悲剧收场的丁丑娃 ；9月主演的爱情喜剧电影《穷途》上映，饰演前往苗寨寻找药方的男主角邹孝宇 ；参演都市情感电视剧《爱情万万岁》，饰演为爱痴狂的90后新新人类金波 ；11月参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》，饰演为情所苦的造型师罗仁 ；11月与黄世超、杨世瀚、张思帆共同演唱的电视剧《蜀山战纪》片尾曲《我就是我》单曲发布 。12月主演民国动作悬疑电视剧《左眼诡事》，饰演左眼能看到鬼魂的男主角尹明涯。 2016年，8月参演都市剧《一粒红尘》，饰演痴情的酒吧老板闵朗 。